Resume “Metode Pemisahan”

 

Pendahuluan

Perbedaan Metabolit Primer dan Sekunder

	Metabolit primer	Metabolit skunder
Distribusi	Merata dalam tiap organisme	Tidak merata
Fungsi	Universal, anatara lain sumber energi, pertumbuhan.	Ekologis, antara lain penarik serangga, pertahanan
Struktur kimia	Perbedaan kecil	Berbeda - beda
Fisiologis	Berkaitan dengan struktur kimia	Tidak berkaitan

Hubungan metabolit primer (biokimia) dan metabolit sekunder (fitokimia) : Metabolit sekunder terbentuk dari metabolit primer melalui berbagai jalur metabolisme yang disesuaikan dengan tujuan dan kondisi lingkungan tumbuhan tersebut tumbuh.

Contoh metebolit primer misalnya glikosida, karbohidrat, dll. Sedangkan contoh metabolit skunder misalnya terpenoid, alkoloid, flavonoid, dll

Ciri – ciri alkaloid, flavonoid, dan terpenoid : Ciri alkaloid (ada senyawa N di dalam struktur). Ciri Flavonoid (bentuk strukturnya C₆C₃C₆). Ciri Terpenoid (kelipatan lima C₅C₁₀C₁₅C₂₀, dst).

Ekstraksi, Fraksinasi, dan Kromatografi

Bahan awal – Ekstraksi – Fraksinasi – Kristalisasi, presipitasi – Purifikasi (kolom kromatografi) – standarisasi  

Sifat fisika yang umum dimanfaatkan unruk ekstraksi dan fraksinasi yaitu: Kelarutan : kecendrunga molekul untuk melrut dalam cairan (ECC). Kepolaran: kecendrungan molekul untuk bercampur yang polaritasnya sama (Kromatografi). Keatsirian: kecendrungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (destilasi dan sublimasi)

Beberapa metode ekstraksi yaitu: Cara panas  (refluks, soxhlet, infus, destilasi, dll). Cara dingin (Maserasi, perkolasi, enfluoreasi, dll)

Fraksinasi adalah proses memisahkan suatu campuran menjadi sekurang-kurangnya dua fraksi yang berbeda komponennya. Tujuan fraksinasi adalah mendapatkan suatu fraksi yang lebih sederhana dari ekstrak dengan memisahkan senyawa-senyawa yang ada dalam campuran ekstrak awal.

Teknik pemisahan: Ekstraksi padat-cair (kelarutan zat dalam pelarut). Ekstraksi cair-cair (koefisien distribusi dan rasio distribusi analit dalam pelarut organik/air). Tekhnik destilasi (rasio distribusi kelarutan analit dalam fase uap pelarut terhadap kelarutan analit dalam pelarut). Kromatografi (tekhnik pemisahan fisika yang didasarkan pada migrasi senyawa pada fase diam akibat pengaruh fase gerak). Elekforesis (tekhnik pemisahan ion (spesi bermuatan) yang didasarkan pada kecepatan migrasinya akibat medn listrik)

Klasifikasi Kromatografi

Berdasarkan tujuan analisis: Kualitatif (indentifikasi), Kuantitatif (penetapan kadar), Preparatif (isolat murni).

Berdasrkan fase gerak: Kromatografi cair, kromatografi gas, dan romatografi fluida.

Berdasarkan bentuk kemasan/geometri fase diam: Kromatografi planar/datar, kromatografi kolom, dan kromatografi kapiler

Berdasarkan mekanisme pemisahan: Adsorpsi, partisi, penukaran ion, afinitas, dan ekslusi molekul/ukuran.

HPLC selain digunakan sebagai kualitatif (identifikasi) sehingga dapat juga digunakan sebagai kuantitatif (penetapan kadar) karena adanya detektor.

Sampel kromatografi dan senyawa yang didpisahkan meliputi: Fase diam (yang mengikat senyawa). Fase gerak (pelarut dan gas). Fase pendukung (kaca plastik atau tempat menempelnya fase diam).

Tiga unsur definisi kromatografi: Pemisahan, distribusi (interaksi dan mobilisasi), fase diam, dan fase gerak.

Parameter uji kromatografi: Rf = a/b. Dimana a = fase gerak, b = fase diam

Perbedaan kualitatif (identifikasi) dan preparatif (isolat murni)

	kualitatif	Preparatif
Lebar permukaan	100 – 250 um	0,5 – 2 mm
Titik awal penotolan	1.5 cm	2-3 cm
Konsentrasi sample	1 ng/ul	200 mg/ml
Jarak perpindahan	10 – 15 cm	20 cm
Penyemprotan reagen	Di tengah plat	Di pinggir plat

Fase diam (polar) – sampel – fase gerak (non polar)

Pemurnian

Pemurnian adalah metode untuk memperoleh isolat. Macam – macam metode pemurnian yaitu: Kristalisasi, pengendapan, KLT preparatif, KKt preparatif, kolom kromatografi, sublimas, dll.

Tekhnik kristalisasi: Rekristalisasi (larutkan sejumlah serbuk/kristal dalam pelarut tertentu, biarkan pelarut menguap dan terbentuk kristal). Pencucian  (tambahkan sejumlah kristal dengan sedikit pelarut tertentu, sehingga kristal larut sedangkan pengotor tidak larut, atau sebaliknya tambahkan sejumlah kristal dengan sedikit pelarut tertentu sehingga pengotor larut sedangkan kristal tidak larut). Pengendapan kristal (larutkan kristal dalam pelarit tertenti (I), ubah kepolaran kristal dengan pelarut lain (II) dengan kepolaran yang sangat berbeda dengan pelarut, kristal akan mengandap)

Pengendapan serbuk amorf. Beberapa senyawa mudah mengendap dan berbentuk amorf adalah: penguapan pelarut (larutkan sejumlah serbuk dalam pelarut tertentu, biarkan pelarut menguap dan terbentuk endapan amorf). Pencucian (tambahkan sejumlah serbuk dengan sedikit pelarut tertentu, sedangkan pengotor tidak larut, atau sebaliknya tambahkan sejumlah serbuk dengan sedikit pelarut tertentu sehingga pengotor larut sedangkan serbuk tidak larut). Pengendapan serbuk (biarkan beberapa waktu atau sentrifuse sampai terbentuk endapan serbuk yang terpisah , jika perlu dialakukan penyaringan)

KLT preparatif

Siapkan bejana (chamber), lapisi bejana dengan kertas saring, siapkan eluen/fase gerak (pelarut tunggal atau campuran), masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat lalu biarkan bejana jenuh dengan uap eluen, sejumlah fraksi/subfraksi kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut sampai diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer, totolkan fraksi/subfraksi secara tidak terputus pada plat KLT preparatif dengan menggunakan pipa kapiler sehingga terbentuk pita (tebal pita maksimum 5 mm), biarkan totolan fraksi/subfraksi mengering (pelarut menguap), masukkan plat yang sudah ditotolkan ke dalam bejana (perhatian : tinggi permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah daripada totolan bercak), biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir plat, dan anngkat plat lalu biarkan plat mengering (pelarut menguap)

Langkah selanjutnya lihat warna-warna pita secar visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika pita tidak berwarna atau tidak berflourosensi di bawah lampu ultraviolet, semprot bagian pinggir kiri dan kanan plat dengan penampak bercak universal asam sulfat 10% dalam metanol. (pada saat penyemprotan, tutup bagian tengah plat). Kerok pita senyawa yang akan diisolasi, kumpulkan pada satu wadah. Masukkan pelarut teretentu kedalam wadah yang berisi kerokan pita, aduk sehingga senyawa yang akan diisolasi larut sedangkan serbuk silica gel tidak larut. Saring dengan kertas saring, sehingga sebagian besar serbuk silika gel akan tertahan di kertas saring. Ulangi penyaringan berkali-kali dengan kapas, sehingga tidak terdapat partikel serbuk silika gel dalam larutan senyawa.

Kromatografi kertas preparatif

Siapkan eluen. Siapkan bejana (chamber). Lapisi bejana dengan kertas saring. Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh dengan dengan uap eluen sekitar 24 jam. Sejumlah fraksi/subfraksi kental dilarutkan dalam beberpa mL pelarut, sampai diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer. Totolkan fraksi/subfraksi secara tidak terputus pada kertas Whatman  No 3 dengan menggunakan pipa kapiler sehingga berbentuk pita (tebal pita maksimum 5 mm). Biarkan totolan fraksi/subfraksi mengering (pelarut menguap) masukkan kertas Whatman yang sudah ditotolkan ke dalam bejana.  (perhatian : tinggi permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah daripada totolan bercak). Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir kertas. Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir kertas. Angkat kertas, biarkan kertas mengering (pelarut menguap)

Langkah selanjutnya lihat warna-warna pita secar visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika pita tidak berwarna atau tidak berflourosensi di bawah lampu ultraviolet, semprot bagian pinggir kiri dan kanan plat dengan penampak bercak khusus. (pada saat penyemprotan, tutup bagian tengah plat). Gunting pita senyawa yang akan diisolasi menjadi bagian – bagian kecil, kumpulkan pada satu wadah. Masukkan pelarut teretentu kedalam wadah yang berisi guntingan pita, aduk sehingga senyawa yang akan diisolasi larut sedangkan kertas tidak larut. Saring dengan kertas saring, sehingga guntingan kertas akan tertahan di kertas saring. Ulangi penyaringan berkali-kali dengan kapas, sehingga tidak terdapat partikel serbuk silika gel dalam larutan senyawa.

Pengemasan kolom

Pemasukan cuplikan: cuplikan disuspensikan dalam sedikit mungkin pelarut yang sama dengan fase gerak yang dipakai. Kemudian dituang perlahan-lahan di atas permukaan adsorben sampai merata. Pengelusian (pembilas lepas): penambahan/penetesan fase gerak harus hati-hati, jangan samapai mengganggu permukaan adsorben. Pengumpulan fraksi: penumpulan fraksi dapat dilakukan dengan manual, dan dapat juga dengan alat pengumpul fraksi otomatik. Volume setiap fraksi tergantung kepada banyaknya cuplikan dan banyaknya jenis senyawa yang dipisah. (Eks, STFB 2013)